Метод хроматографии на бумаге относится к плоскостной хроматографии, он основан на распределении анализируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.
В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Вещество присутствует в обеих фазах в виде раствора. Неподвижная фаза удерживается в порах хроматографической бумаги, не взаимодействуя с ней, бумага выполняет функцию носителя неподвижной фазы.
Виды хроматографической бумаги:
1) гидрофильная бумага удерживает в порах до 22 % воды; неподвижная фаза – вода, подвижная – органический растворитель; такая бумага применяется для определения водорастворимых веществ.
2) гидрофобная бумага отталкивает воду, поэтому ее пропитывают неполярным органическим растворителем (неподвижная фаза); подвижная фаза – вода; такая бумага применяется для определения нерастворимых в воде соединений (жирорастворимые кислоты, витамины).
К хроматографической бумаге предъявляются следующие требования:
¨ химическая чистота;
¨ химическая и адсорбционная нейтральность по отношению к анализируемым веществам и подвижной фазе;
¨ однородность по плотности;
¨ одинаковая направленность волокон.
Для получения хроматограммы на бумагу наносят каплю анализируемой смеси. Бумагу помещают в хроматографическую камеру, ее конец погружают в сосуд с элюентом. Растворитель продвигается по бумаге, смесь анализируемых веществ распределяется между подвижной и неподвижной фазами и разделяется на бумаге в виде пятен или полос. Положение зон компонентов определяют проявлением хроматографической бумаги соответствующими реагентами, которые с компонентами разделяемой смеси образуют окрашенные соединения.
Для количественной оценки способности разделения веществ в хроматографической системе применяют коэффициент распределения К р – отношение концентрации вещества в неподвижной и подвижной фазах. Экспериментальное установление коэффициентов распределения в данном методе невозможно, для оценки способности разделения веществ на бумаге применяют коэффициент смещения (подвижности) R f . Коэффициент смещения равен отношению скорости движения вещества () к скорости движения подвижной фазы (). Экспериментально величину R f находят как отношение расстояния Х, пройденного веществом, к расстоянию Х f , пройденному растворителем от старта до линии фронта:
.
Коэффициент R f изменяется в пределах 0 – 1,00. Величина R f зависит от природы определяемого вещества, вида хроматографической бумаги, качества и природы растворителя, способа нанесения пробы, техники эксперимента и температуры. Коэффициент R f не зависит от концентрации определяемого вещества и присутствия других компонентов.
Идентификацию по хроматограмме выполняют следующими способами:
¨ визуальным сравнением характерной окраски зон веществ на исследуемой и стандартной хроматограммах;
¨ измерением коэффициентов подвижности R f для стандартного и анализируемого вещества в определенном растворителе. Хроматографирование и установление R f для исследуемой и стандартной смесей проводят на одинаковой бумаге и в одной камере в строго идентичных условиях. Сопоставляя коэффициенты R f , делают заключение о присутствии в анализируемой смеси тех или иных компонентов.
Количественное определение выполняют непосредственно по хроматограмме или при вымывании (элюировании) анализируемого вещества с бумаги.
Способы количественного анализа:
¨ визуальное сравнение интенсивности окраски пятен на исследуемой и стандартной хроматограммах (полуколичественное определение, точность 15 –20 %);
¨ измерение площади пятна, образованного данным компонентом, и нахождение концентрации вещества по градуировочному графику, построенному для серии стандартных растворов в координатах: площадь пятна – концентрация вещества; точность определения 5 – 10 %;
¨ элюирование определяемого вещества с поверхности хроматограммы и спектрофотометрическое или флуориметрическое измерение оптической плотности элюата (А); концентрацию вещества в растворе рассчитывают по формуле:
где К – коэффициент пропорциональности; S – площадь пятна, измеренная предварительно, мм 2 ; точность определения 1 %.
По способу хроматографирования различают восходящую (рис. 21), нисходящую (рис. 22), круговую (рис. 23), градиентную и двухмерную хроматографии.
Метод хроматографии на бумаге широко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии.
Метод нашел применение в анализе практически всех пищевых продуктов: в сахарном производстве – для определения углеводов; в хлебопекарном и кондитерском – аминокислот, органических кислот, углеводов, полисахаридов и карбонильных соединений; в виноделии – органических кислот и аминокислот; в производстве молока и молочных продуктов – аминокислот; в мясоперерабатывающей промышленности – фенолов, жирных и летучих кислот, аминокислот и карбонильных соединений.
Распределительная хроматография. Бумажная хроматография. Осадочная хроматография. Понятие оситовой (эксклюзионной) хроматографии. Гель-хроматография.
Распределительная хромотография.
хроматографический метод, при котором неподвижная (стационарная) фаза химически связана с поверхностью неподвижного носителя. Подвижной фазой является жидкость, которая служит растворителем, или газ (газовая хроматография). Разделение происходит за счёт различия полярности разделяемых веществ. При распределительной хроматографии носитель пропитывается одним из растворителей (“неподвижный растворитель”), а другой растворитель (“подвижный ”) пропускают через колонку носителя. В качестве неподвижного растворителя чаще всего берут воду или другие полярные жидкости (серную кислоту, метиловый спирт и т.д.); в качестве подвижного растворителя - менее полярные жидкости, не смешивающиеся с первыми во всех соотношениях. Порцию исследуемой смеси веществ, растворенную в подвижном растворителе, вводят в колонку и после того, как раствор впитается верхней частью колонки, начинают промывание колонки чистым подвижным растворителем. В процессе промывания происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Так как разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, скорость передвижения отдельных компонентов различная. Наибольшей скоростью движения будет обладать тот компонент смеси, который имеет наибольший коэффициент распределения: C
C = неподв.
т.е. отношение концентраций растворенного вещества в подвижной фазе к его концентрации в неподвижной фазе.
Одним из основных условий получения четкого разделения смеси методом распределительной хроматографии является практическое отсутствие какого-либо взаимодействия компонентов смеси с носителем. Если это условие соблюдается, то при промывании колонки происходит полное разделение смеси. Число носителей, пригодных для распределительной хроматографии, крайне ограничено. Более или менее удовлетворительными качествами обладают такие носители, как особым образом, приготовленный силикагель, очищенный крахмал, целлюлоза.
Бумажная хромотография.
берется полоса фильтровальной бумаги длиной 30-50 см и шириной 1,5 см. На один из концов этой полосы на некотором расстоянии от края наносится капля смеси анализируемых веществ. Затем этот конец бумаги опускается в ванночку, содержащую органический растворитель, насыщенный водой. При медленном продвижении растворителя через поры бумаги происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя жидкими фазами. Если разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, то скорость продвижения отдельных компонентов смеси будет различной. Движение подвижного растворителя по бумаге может быть как нисходящим, так и восходящим. После того, как хроматографирование заканчивается, полосу бумаги высушивают и затем проявляют реактивом, дающим цветную реакцию с анализируемыми соединениями. Полученная хроматограмма представляет собой совокупность цветных пятен, расположенных в определенном порядке вдоль полосы бумаги.
Рис. 22. А - восходящая хроматограмма; Б - нисходящая хроматограмма; 1 - сосуд для хроматографирования; 2 - резервуар с растворителем; 3 - хроматографическая бумага; 4 - стартовые точки; 5 - разделенные компоненты; 6 - фронт растворителя.
При нисходящей хроматографии растворитель движется вниз по бумаге из расположенного в верхней части сосуда резервуара с растворителем. Таким способом можно элюировать отдельные компоненты. Наиболее распространенные системы растворителей: СН3СООН-Н2O (15:85 объем), 1-бутанол - СН3СООН-Н20 (4:1:5), 2-пропанол - NH3 (конц.) - Н2O (9:1:2), 1-бутанол - 1,5 н. NH3 (1:1), фенол - вода и др. Состав подвижной фазы обычно подбирают экспериментально или ориентируясь на данные, приведенные в справочниках или монографиях по бумажной хроматографии.
Осадочная хроматография - метод хроматографии, основанный на способности разделяемых веществ образовывать малорастворимые соединения с различными произведениями растворимости. В качестве неподвижной фазы выступает инертный носитель, покрытый слоем осадителя; разделяемые вещества, находящиеся в подвижной фазе, вступают во взаимодействие с осадителем и образуют малорастворимые вещества - осадки. При дальнейшем пропускании растворителя происходят поочерёдно: растворение этих осадков, перенос вещества по слою неподвижной фазы, снова осаждение и т. д. При этом скорость перемещения осадка по неподвижной фазе пропорциональна его произведению растворимости (ПР). Хроматограммой в данном случае будет являться распределение осадков по слою носителя. В качестве примера можно привести разделение галогенид-ионов на носителе (силикагель, целлюлоза и т. д.), пропитанном солью серебра. Можно использовать для разделения осадков их неодинаковую растворимость в различных растворителях или в растворах с различной ионной силой. Реализуется как в колоночном, так и в плоскостном варианте.
Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) - разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует. В колонку вносят раствор образца, объём которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объёма колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определенного диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объём удержания равен объёму колонки за вычетом объёма стационарной фазы (так называемый, свободный объем). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объём удержания несколько выше свободного объёма. Они элюируется вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объём удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объёму колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.
Качественный химический анализ. Классификация методов качественного анализа (дробный и систематический, макро-, полумикро-, микро-, ультрамикроанализ). Аналитические реакции и реагенты, используемые в качественном анализе (специфические, селективные, групповые). Использование качественного анализа в фармации.
Качественный анализ - идентификация (обнаружение) компонентов анализируемых веществ и приблизительная оценка количества их содержания в веществах и материалах. В качестве компонентов могут быть атомы и ионы, изотопы элементов и отдельные нуклииды, молекулы, функциональные группы и радикалы, фазы и т.д.
Классификация методов Метод анализа выбирают в зависимости от предполагаемого содержания вещества и от предела обнаружения применяемой реакции. В настоящее время при изучении качественного химического анализа в учебных лабораториях применяется полумикроанализ.
При бумажной хроматографии неподвижной жидкой фазой служит вода, адсорбируемая волокнами бумаги в количестве до 20%, ил другой полярный растворитель; в качестве подвижной фазы чаще всего применяют бутиловый спирт, коллидин, фенол, крезолы. Носителем служит хорошая фильтрованная бумага, достаточно однородная по толщине и плотности.
Для разделения смеси способом бумажной хроматографии каплю исследуемого раствора наносят на полоску фильтрованной бумаги шириной 15-20 мм и длиной 300-500 мм на расстоянии 20-30 мм от конца. Конец полоски погружают в соответствующий органический растворитель, предварительно насыщенной водой, а весь прибор помещают в герметическую камеру, атмосфера в которой насыщена парами органического растворителя и воды. Движение растворителя вдоль полоски бумаги, происходящее вследствие капиллярных сил, обеспечивает проявление хроматограммы, причем отдельные зоны перемещаются с различной скоростью.
Двумерная хроматография на бумаге
Еще более точные результаты получаются при помощи так называемой двухмерной хроматографии на бумаге. Для этого варианта применяют не полоски фильтрованной бумаги, а прямоугольники размером примерно 400Х500 мм. Каплю исследуемого раствора наносят вблизи одной из вершин прямоугольника, а Хроматограмму проявляют дважды различными растворителями, например фенолом и коллидином, сперва одним растворителем, а затем, после поворота на 90?, -другим.
Методы проявления хроматограмм
Восходящая хроматография. Бумага погружается нижним концом в подвижную фазу. Подъём жидкости происходит под действием капиллярных сил.
«+» Прибор прост, возможна количественная оценка результатов;
«-» Сила тяжести и капиллярные силы действуют в противоположных направлениях; скорость всасывания после подъема до 20 см сильно падает. Применима для веществ, имеющих достаточно большие различия в значениях Rf
Нисходящая хроматография. Бумага погружается в подвижную фазу верхним концом. Стекание жидкости происходит под действием силы тяжести.
«+» - быстрое прохождение подвижной фазы; отсутствие ограничения длины пробега пятен (проточная хроматограмма); возможно разделение веществ с незначительно отличающимися значениями Rf и количественная оценка результатов.
«-» - Прибор сложнее, чем для восходящей хроматографии.
Рис. 5.
Радиально-горизонтальная хроматография. Подвижная фаза непрерывно наносится в центр круглого листа бумаги.
«+» - Быстрое выполнение, зоны узки и резко очерчены; большая полнота разделения, чем для первых методов.
«-» - Возможна только качественная оценка результатов; применение «свидетелей» возможно только лишь при так называемом «секретном методе» (т.е. при делении бумаги на секторы).
Приготовление подвижной фазы
Ниже описан простейший случай хроматографии на бумаге - восходящая хроматография с водой в качестве восходящей фазы.
Компоненты выбранной системы растворителей смешивают в указанном соотношении в делительной воронке. Две несмешивающиеся фазы доводят при помощи встряхивания до взаимного насыщения; в качестве подвижной фазы выступает органическая.
Нанесение вещества
Из бумаги определенного сорта вырезают полоску, размер которой соответствует размерам применяемого для хроматографии цилиндра. На расстоянии 3 см от нижнего края карандашом наносят маркировочную линию. На этой линии через 2 - 2,5 см друг от друга и от краев полоски помечают точки старта. Специальной пипеткой наносят каждую точку старта; при этом образуются пятна около 1 см в диаметре. Затем растворителю дают испариться.
тонкослойный хроматография растворитель бумага
Проявление
На дно цилиндра наливают подвижную фазу и подвешивают полоску бумаги. Оставляют ее так висеть в течение ночи, а затем нижний край полоски погружают на 0,5 см в подвижную фазу. После того как растворитель поднимется на 20 - 25 см, полоску вынимают, отмечают карандашом положение фронта растворителя и Хроматограмму высушивают.
Метод хроматографии на бумаге относится к плоскостной хроматографии, он основан на распределении анализируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.
В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Вещество присутствует в обеих фазах в виде раствора. Неподвижная фаза удерживается в порах хроматографической бумаги, не взаимодействуя с ней, бумага выполняет функцию носителя неподвижной фазы.
Виды хроматографической бумаги:
гидрофильная бумага удерживает в порах до 22 % воды; неподвижная фаза – вода, подвижная – органический растворитель; такая бумага применяется для определения водорастворимых веществ.
гидрофобная бумага отталкивает воду, поэтому ее пропитывают неполярным органическим растворителем (неподвижная фаза); подвижная фаза – вода; такая бумага применяется для определения нерастворимых в воде соединений (жирорастворимые кислоты, витамины).
К хроматографической бумаге предъявляются следующие требования:
химическая чистота;
химическая и адсорбционная нейтральность по отношению к анализируемым веществам и подвижной фазе;
однородность по плотности;
одинаковая направленность волокон.
Для получения хроматограммы на бумагу наносят каплю анализируемой смеси. Бумагу помещают в хроматографическую камеру, ее конец погружают в сосуд с элюентом. Растворитель продвигается по бумаге, смесь анализируемых веществ распределяется между подвижной и неподвижной фазами и разделяется на бумаге в виде пятен или полос. Положение зон компонентов определяют проявлением хроматографической бумаги соответствующими реагентами, которые с компонентами разделяемой смеси образуют окрашенные соединения.
Для
количественной оценки способности
разделения веществ в хроматографической
системе применяют коэффициент
распределения К р
– отношение концентрации вещества в
неподвижной и подвижной фазах.
Экспериментальное установление
коэффициентов распределения в данном
методе невозможно, для оценки способности
разделения веществ на бумаге применяют
коэффициент смещения (подвижности) R f .
Коэффициент смещения равен отношению
скорости движения вещества ()
к скорости движения подвижной фазы (
).
Экспериментально величину R f
находят как отношение расстояния Х,
пройденного веществом, к расстоянию
Х f ,
пройденному растворителем от старта
до линии фронта:
.
Коэффициент R f изменяется в пределах 0 – 1,00. Величина R f зависит от природы определяемого вещества, вида хроматографической бумаги, качества и природы растворителя, способа нанесения пробы, техники эксперимента и температуры. Коэффициент R f не зависит от концентрации определяемого вещества и присутствия других компонентов.
Идентификацию по хроматограмме выполняют следующими способами:
визуальным сравнением характерной окраски зон веществ на исследуемой и стандартной хроматограммах;
измерением коэффициентов подвижности R f для стандартного и анализируемого вещества в определенном растворителе. Хроматографирование и установление R f для исследуемой и стандартной смесей проводят на одинаковой бумаге и в одной камере в строго идентичных условиях. Сопоставляя коэффициенты R f , делают заключение о присутствии в анализируемой смеси тех или иных компонентов.
Количественное определение выполняют непосредственно по хроматограмме или при вымывании (элюировании) анализируемого вещества с бумаги.
Способы количественного анализа:
визуальное сравнение интенсивности окраски пятен на исследуемой и стандартной хроматограммах (полуколичественное определение, точность 15 –20 %);
измерение площади пятна, образованного данным компонентом, и нахождение концентрации вещества по градуировочному графику, построенному для серии стандартных растворов в координатах: площадь пятна – концентрация вещества; точность определения 5 – 10 %;
элюирование определяемого вещества с поверхности хроматограммы и спектрофотометрическое или флуориметрическое измерение оптической плотности элюата (А); концентрацию вещества в растворе рассчитывают по формуле:
,
где К – коэффициент пропорциональности; S – площадь пятна, измеренная предварительно, мм 2 ; точность определения 1 %.
По способу хроматографирования различают восходящую (рис. 21), нисходящую (рис. 22), круговую (рис. 23), градиентную и двухмерную хроматографии.
|
Рис. 21. Камера для восходящей хроматографии: 1 – пробка; 2 – крючок; 3 – стеклянный сосуд; 4 – полоска бумаги; 5 – растворитель |
|
|
Рис. 22. Хроматографическая камера для нисходящей хроматографии: 1 – растворитель; 2 – перекладина для бумаги; 3 – полоска бумаги; 4 – стеклянный сосуд; 5 – стекающий растворитель |
|
|
Рис. 23. Разделение веществ методом круговой хроматографии: 1– хроматографическая бумага; 2 – крышка; 3 – чашка Петри; 4 – органический растворитель |
Метод хроматографии на бумаге широко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии.
Метод нашел применение в анализе практически всех пищевых продуктов: в сахарном производстве – для определения углеводов; в хлебопекарном и кондитерском – аминокислот, органических кислот, углеводов, полисахаридов и карбонильных соединений; в виноделии – органических кислот и аминокислот; в производстве молока и молочных продуктов – аминокислот; в мясоперерабатывающей промышленности – фенолов, жирных и летучих кислот, аминокислот и карбонильных соединений.
Вместо пластинок с нанесенным тонким слоем сорбента можно использовать специальную хроматографическую бумагу в виде листов или полосок. Хроматографическая бумага должна быть химически чистой, нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижной фазе и быть однородной по плотности; имеют значение структура молекул целлюлозы в бумаге, ориентация волокон и другие свойства, влияющие на скорость движения подвижной фазы. Основные операции в бумажной хроматографии проводятся примерно так же, как и в тонкослойной.
Для разделения водорастворимых веществ, например, неорганических ионов, в качестве подвижной фазы обычно берут органический растворитель, а в качестве неподвижной – воду (бумагу заранее смачивают водой). Для разделения компонентов, хорошо растворимых в органических растворителях, гидрофильную бумагу превращают в гидрофобную, пропитывая ее растворами органических веществ (парафина, растительного масла и др.), а в качестве подвижной фазы используют воду, водный раствор какой-либо кислоты или щелочи, буферный раствор.
Растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворители должны легко удаляться с бумаги. Индивидуальные растворители используются достаточно редко. Чаще для этой цели применяют смеси веществ, например, бутилового или амилового спирта с метиловым или этиловым, смеси бутилового спирта с уксусной кислотой, аммиаком и др.
По технике выполнения различают следующие виды бумажной хроматографии: одномерную, двумерную, круговую и электрофоретическую . Для получения двумерных хроматограмм хроматографирование проводят дважды: после обработки пробы одним растворителем хроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другим растворителем. Такая методика позволяет проводить более тонкие разделения компонентов смеси. Специфическим приемом является сочетание БХ и электрофореза. Для этого к влажному листу хроматографической бумаги прикладывают постоянное электрическое напряжение. Дополнительное воздействие электрического поля приводит к более четкому разделению, особенно для ионов с разными зарядами. Электрофорез можно проводить одновременно с хроматографированием, а также до или после хроматографирования.
Качественный состав пробы в методе бумажной распределительной хроматографии так же, как и в ТСХ, может быть установлен или по специфической окраске отдельных пятен на хроматограмме, или по численному значению R f каждого компонента. Количественные определения в БХ выполняются по хроматографическим характеристикам (по площади пятна на хроматограмме и интенсивности его окраски) или после вымывания подходящим физико-химическим методом. Отметим, что метод бумажной хроматографии, предложенный в 1941 г. Мартином и Синджем, в настоящее время используют в аналитических лабораториях довольно редко.
Вопросы для самоконтроля
Каковы преимущества двумерной хроматографии перед одномерной бумажной или ТСХ?
Как идентифицировать пятна органических соединений в методе ТСХ?
Как выполняют количественный анализ в методе ТСХ?
Как определяют R f в методе БХ и ТСХ? От чего зависит величина R f и какие условия нужно поддерживать постоянными при проведении эксперимента?
Как можно определить концентрации компонентов смеси после разделения методом БХ или ТСХ?
Как выполняется качественный анализ с помощью плоскостных вариантов хроматографии – БХ и ТСХ?
Какими способами проба анализируемой смеси веществ вводится в хроматографическую установку в бумажной хроматографии?
Почему в методе ТСХ необходимо герметически закрывать камеру с растворителем и пластинкой во время подъема фронта растворителя?
Как обнаруживают и идентифицируют компоненты на бумажных и тонкослойных хроматограммах?
Каковы области применения, достоинства и недостатки тонкослойной хроматографии?